即使是常规用药，亦应对MTX的毒副作用有充分估计，尤其是治疗增殖快的肿瘤。副作用的产生及严重程度常与剂量相关，与尿液酸度成正比。由于MTX主要在肾脏排泄，若肾功能受损，则应考虑中毒的可能，并会伴有血清MTX水平的增高。最常见的副作用是恶心，呕吐，吞咽困难，口腔炎，咽炎，白细胞和血小板减少。造血系统方面：早期的骨髓抑制（短期给药或大剂量注射后出现，为期7-10天，约一周后恢复）。毒性严重时可致白细胞，血小板出现短暂性降低甚至生成障碍，贫血和低丙种球蛋白血症（大剂量间歇性治疗时少见）。也会出现出血和败血症。消