拉曼光谱技术助您玩转逆向工程

2016 年2 月，国务院办公厅正式印发了《关于推进仿制药质量和疗效一致性评价的意见》，对企业开展仿制药疗效一致性评价的工作做出了部署，明确要求2018年底之前完成2007 年10 月1 日新的药品注册办法实施前批准的，国家基本药物目录中化学药品仿制药口服固体制剂的一致性评价。届时，没有通过评价的，注销药品批准文号。对其他已批准上市的药品，自首家品种通过一致性评价后，其他生产企业的相同品种在3年内仍未通过评价的，注销药品批准文号。该文件明确要求制药企业需对原研制剂进行更精确的透彻解析，也就是通常所说的“逆向工程”，以达到与原研的“一致性”。

在欧美大型药企，从事逆向工程的部门是一个重要部门，而且所涉及的分析方法也比较多。本文将重点介绍其中比较新型的光谱技术之一————拉曼光谱。拉曼效应的产生是来源于单色辐射光源与具有高度可极化的官能团的相互作用，从而导致光源频率发生变化，即光子的非弹性散射，又称为拉曼散射。若频率减小，称为斯托克斯散射；若频率增强，则称为反斯托克斯散射。拉曼光谱利用拉曼散射，获得拉曼光谱信号，对拉曼光谱进行分析，可得到分子振动、转动方面的信息。现在普及的商业化拉曼仪器主要是利用斯托克斯散射信号。反斯托克斯拉曼散射光谱（Coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy，CARS）也逐渐从实验室的开发应用发展为可普及的商业化设备。另外，拉曼信号主要来源于高度可极化的官能团，非对称的、具有高偶极矩的基团不能产生强的拉曼散射，大多数药物分子都具有可极化的官能团，有着很好的拉曼散射效应，因此，拉曼光谱技术在药物检测方面能够得到广泛的应用。拉曼光谱在药物检测方面的主要优势集中在：所需样品少（1~2 mg），最小程度处理样品，不仅适用于药物粉末，还适用于液体制剂和固体制剂的快速、无损性检测分析。通过拉曼光谱能够解决一些逆向工程分析中的疑难点比如药物活性成分（API）的晶型鉴定、原研制剂的成分确定，以及工艺参数的解析，如API 分布、包衣层厚度、包衣层数、生产工艺，以及与溶出特性有函数关联的空间分布等。

1 API 晶型分析

大多数情况下，原研药企业会使用API 最稳定的晶型以避免在生产储存过程中发生晶型转变。为保险起见，仿制药企业通常会选择与参比制剂（RLD）或原研制剂相同的API 晶型，以保证相似的稳定性和溶出特性。此外，如果原研药在化合物专利到期后，使用有效的药物晶型专利来延长保护期限，仿制药企业则必须使用另一种晶型来规避专利。因此，确定原研制剂中API 晶型是仿制药研发的关键步骤，这也是逆向工程中最重要的任务。晶型检测有着一系列可选择的分析方法，如X 射线粉末衍射、差示扫描量热、热重分析、振动光谱（远红外光谱，红外光谱及拉曼光谱），以及相对较新的方法，如太赫兹光谱（Terahertz spectroscopy）、CARS、同步辐射X 射线高分辨衍射（Synchroton XRPD）、核磁共振成像（NMR imaging）等。然而，对于制剂中无定形或低含量API 的晶型检测，可用的方法就相对较为局限。

1.1 制剂中无定形API 的检测

X 射线粉末衍射被认为是多晶型化学物质指纹性和专属性的首选表征手段。一般制剂中的API 晶型检测相对直接，但当API 为无定形时，X 射线粉末衍射检测失去作用，如下所述案例。已知某制剂中API 有2 种固态形式：无定形和半水合物。为确定2 个不同厂家生产的片剂（药片A、B）中API 晶型是否一致，首先需要应用X 射线粉末衍射对药片A、B 中API 晶型进行鉴定。对比药片A、B 与API 的X 射线粉末衍射图可见，药片A 的X 射线粉末衍射图谱与API 半水合物特征峰在整个图谱上都有很高的吻合度（见图1a 和 1d）。因为该API 只能以无定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定药片A 所含API 为半水合物。当比较药片B 的X 射线粉末衍射图谱（见图1b）与API 半水合物时，很难判断药片B中的API 是否也为半水合物。由于药片中同时含有晶体辅料（如乳糖）和其他无定形辅料，药片B 中API的晶型无法通过X 射线粉末衍射来确定。

应用拉曼光谱技术，比对图2 中药片A、B 与API 的拉曼光谱图。药片A 的拉曼图谱与API 半水合物的图谱基本一致（见图2a 和2d）。同时，药片B 的拉曼图谱与无定形API 的图谱基本一致（见图2b 和2c）。因此，在这种情况下，拉曼光谱可以很好地解决无定形API 在制剂中的鉴定问题。通常，不同固态形式API 的拉曼光谱间有一定差异。与结晶形API 相比，无定形API 的拉曼光谱表现为更宽的峰形，且有波数偏移。通过将实测样品的拉曼光谱与不同晶型API 的参考拉曼光谱进行比对，可鉴定制剂中API 的晶型。

值得一提的是，通常辅料拉曼信号很弱，低于API 信号，故拉曼技术用于不同厂家不同辅料的相同制剂时，可以在某些情况下完全排除辅料对API 的干扰。该特性极利于制剂中低含量API 的晶型检测，即使API 的含量较低，其在制剂中的信号仍然有可能被检测到，这对于制剂中API 的晶型鉴定尤为重要。

1.2 制剂中低含量API 的检测

某原研片中API 含量较低，仅为0.5%。文献报道，该API 有A、B、E 这3 种晶型，且晶型E 很难制备。比较原研片与文献中3 种晶型的X 射线粉末衍射图，未找到与3 种晶型相对应的衍射峰，再将原研片与片剂中主要辅料一水乳糖的X 射线粉末衍射图比较，发现其X射线粉末衍射图与一水乳糖几乎一致（见图3）；辅料一水乳糖严重干扰了制剂中API 的衍射信号。